RNA-DNA STAT 60說(shuō)明書(shū)

從同一樣品中分離總RNA/mRNA和DNA的兩種單提取試劑

除去上清液，清洗RNA沉淀  一次  含75%乙醇  l  by  渦旋  和  后續(xù)  以7.500g（大值）離心5 min  4°  C.  添加  at  病變  I  ml 75%乙醇/ml  的  RNA  STAT-60TM  使用  對(duì)于初始均質(zhì)化。

程序結(jié)束時(shí)，短暫干燥RNA沉淀(5-10 min)。重要的是不要使RNA沉淀*干燥，因?yàn)樗鼘⒋蟠? 減少  it  溶解度。  請(qǐng)勿使用  用于干燥的Speed-Vac。溶解RNA  水或(l mM)EDTA中沉淀。pH 7?；?.5%SDS溶液。渦旋或使團(tuán)塊通過(guò)  a  很少  次  通過(guò)  a  移液器吸頭?？赡苄枰?5-60 ℃下孵育10-15 min以溶解RNA。經(jīng)焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的無(wú)RNase溶液  be  使用  對(duì)于RNA的如此輕浮。

6. 預(yù)期收率和純度：

總RNA的預(yù)期yie ld：

1. 毒性（µg/mg組織）：活r，脾臟，7-10µg；悉尼，3-4µg；腦骨骼肌，1-1.5µg；胎盤(pán)1-4

µg .

2. 培養(yǎng)細(xì)胞(pe r/10 6ce lls)：上皮細(xì)胞，10-15 tg。成纖維細(xì)胞，5-7µg。

總RNA的終制備液不含DNA  和蛋白質(zhì)，260/280比值 > 1.8。

7. 注釋和評(píng)論：

I. 對(duì)于少量細(xì)胞或組織(1-10 mg)的RNA同分異構(gòu)體：將樣品在0.8 mL tl1e RNA ST AT-6QTM中勻漿，將勻漿轉(zhuǎn)移至Eppendorf管中，并遵循isola ti on方案。RNA沉淀應(yīng)在-20 ℃下進(jìn)行30 min的離子除外。需要添加載體r，如糖原。

2. 以下   均質(zhì)化離子   （之前    添加    的氯方）樣品可在-70 ℃保存至少2周。

3. 在酶譜分析中，可能需要加入itiona l沉淀以使用由RNA STAT-60TM等長(zhǎng)的RNA。如此lubili化后，在0.2 MNaCl和2倍體積乙醇l存在下沉淀RNA，用于  在-20 °C下15 min。PCR和RNase保護(hù)試驗(yàn)不需要這種傳統(tǒng)的沉淀。

4. 手和灰塵可能是RNase污染的主要來(lái)源。使用手套并保持試管密閉。在整個(gè)過(guò)程中建議使用steri le,disposab le聚丙烯管。

RNA STAT-60TM co ntains the poiso n(pheno l)and the irritant(guan idiniu m).可能致命。當(dāng)使用RNA STAT-6 QTM時(shí)，使用手套和護(hù)目鏡（護(hù)罩、護(hù)目鏡）。請(qǐng)勿接觸皮膚或衣物。避免吸入蒸汽。同時(shí)閱讀藥瓶上的警告說(shuō)明。請(qǐng)勿將RNA STAT-60TM暴露于強(qiáng)烈的酸性溶液中。

方案對(duì)象  DNA   反向   從用于RNA提取的樣品中提取

DNA反向提取

取出后  的  水  層包含  RNA，  添加  800 μL DNA STAT-60試劑/ml RNAzol。RNAzol B或RNA STAT-60  使用  針對(duì)  的  初始  均質(zhì)化離子。添加  0.2 mL氯芬/ml  DNA  STAT-60、  奶昔  用力靜置15秒，然后在室溫下靜置  溫度  針對(duì)  2-3 min。在4 ℃下以2000 g（小值）-12000 g（大值）離心勻漿15 min。  滲出性  同源nate分為2個(gè)相：  a  下部器官ic  相和上層水相。DNA保留在水相中，而蛋白質(zhì)處于間期和有機(jī)相中。

DNA制備

轉(zhuǎn)換器  的  水溶液  相  to   a   新鮮的   管   和   混合   含異丙醇。每毫升加入0.5 mL異丙醇  of  的  使用的DNA STAT-60  針對(duì)  均質(zhì)化。  Sto re  樣品s  at  -20°C  30 min，離心機(jī)  12,000g  （大值）  針對(duì)  LO  分鐘  4 °C下。DNA  沉淀  翅  小  澄清  to  白色  微丸  在底部  of  的  試管。  委托方  小樣本，  添加  of  a  可能需要載體(g lycoge n)d。

DNA洗滌

除去上清液，用75%乙醇渦旋清洗DNA沉淀一次，隨后在4 ℃下以7,500g（多）離心5 min。按照1 mL 75%乙醇  ml   of   的   DNA   STAT-60   使用   針對(duì)   的   初始  同質(zhì)尼扎離子。

在程序結(jié)束時(shí)，通過(guò)風(fēng)干(5-10 min)干燥簡(jiǎn)單的DNA團(tuán)塊很重要，不要使團(tuán)塊過(guò)度干燥，因?yàn)樗鼘⒋蟠蠼档推淙绱说娜犴g性。將DNA沉淀溶于水或1 mm edta(pH 8.Vo rtex)中或通過(guò)移液器吸頭使沉淀通過(guò)幾次。可能需要在55-60 ℃下孵育10-15分鐘以溶解DNA樣品。

特殊處理注意事項(xiàng)

DNA STAT-60™含有刺激物(g ua nidinium)  并且可能是致命的。當(dāng)與  DNA  STAT-60  使用  手套和護(hù)目鏡（護(hù)罩，  安全性  護(hù)目鏡）。請(qǐng)勿  得到  皮膚或衣服上。避免吸入蒸汽。閱讀瓶上的警告說(shuō)明。請(qǐng)勿將DNA STAT-60暴露于酸性環(huán)境中。

參考文獻(xiàn)

I. Chomczynks I. P.和  Sacchi,  1987.  單步  方法  的RNA Iso化通過(guò)酸性胍硫氰酸銨-苯酚l­氯方提取。生物技術(shù)8:14 8-1 49。

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